炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質與染料疊氮化物或炔烴的綴合

蛋白質標記緩沖液適用于 CuAAC 與蛋白質的反應，可保護生物分子免受活性氧的損害。該反應可用于具有炔烴或疊氮基團的蛋白質，以及用疊氮基團代謝標記的細胞或細胞裂解物的組分。

疊氮化物與末端炔烴綴合，形成五元雜環（1,2,3-三唑）。這兩個基團（疊氮基和炔烴）在天然生物分子中都極為罕見，因此該反應具有高度特異性，可以有效地處理各種任務。

該反應在銅 (I) 化合物存在下進行，幾乎不依賴于 pH 值。蛋白質標記緩沖液針對蛋白質操作進行了優化，含有銅 (II) 鹽（催化活性銅 (I) 化合物的穩定前體）、醋酸三乙銨 pH 6.8、水溶性 THPTA 配體和氨基胍。建議使用新鮮配制的 抗壞血酸溶液減少銅(II)。蛋白質標記緩沖液中的 THPTA 配體通過穩定銅 (I) 的催化活性化合物來加速反應。 THPTA 配體的存在還允許在水介質（無有機溶劑）中進行蛋白質標記，并且由于銅 (I) 氧化程度的穩定，最大限度地減少活性氧 (RAS) 的產生，并防止它們通過氧化組氨酸、蛋氨酸來損壞蛋白質和半胱氨酸。蛋白質標記緩沖液中的氨基胍可防止化學反應性醛（脫氫抗壞血酸水解產物）與精氨酸、N 末端半胱氨酸和賴氨酸的側鏈結合。

對于此反應，您將需要無疊氮鈉緩沖液中的炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質、疊氮染料或 炔烴、1.5х蛋白質標記緩沖液和抗壞血酸。建議在惰性氣體（氮氣或氬氣）下執行步驟 6 至 9。

協議

我們推薦以下方案用于修飾蛋白質與染料衍生物的綴合：

1. 根據要使用的修飾蛋白的量確定總反應體積：

   ！炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質溶液的體積不應超過總反應體積的1/3。

   總反應體積，μL	蛋白質含量
   100	4至20納摩爾
   200	20至40納摩爾
   400	40至80納摩爾
   600	80 至 600 納摩爾

2. 使用下表計算標記反應的試劑體積：

   試劑	體積，微升	原液濃度
   染料疊氮化物或炔烴	（蛋白質含量 [nmol]）× 0.3*	10 mM DMSO 或水
   蛋白質標記緩沖液	（總反應體積[μL]）×0.67	1.5倍
   活化劑（抗壞血酸）	（總反應體積[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水	（總反應體積 [μL] – 染料溶液體積 [μL] – 蛋白質標記緩沖液體積 [μL] – 活化劑溶液體積 [μL]）	—

   * 染料過量可能會根據蛋白質分子上疊氮化物或炔基的數量而變化。表中顯示的計算結果為 3 倍過量的染料。對于 1.5–10 倍過量的染料，將蛋白質含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但請記住，如果您使用不溶于水的疊氮化物或炔烴，則過量時它可能會從反應混合物中沉淀出來。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

3. 準備 染料疊氮化物或炔烴（10 mM 溶于 DMSO 或水中，適用于水溶性炔烴和疊氮化物）和活化劑（抗壞血酸，50 mM 水溶液）的儲備溶液。

   請記住，抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液 （該溶液在 1 天內穩定）。要制備儲備溶液，請將 10 mg 抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 將蛋白質標記緩沖液添加到修飾的蛋白質溶液中并渦旋。

5. 添加計算體積的疊 氮化染料或炔烴儲備溶液，并再次渦旋均勻。

6. （推薦）對混合物進行脫氣以除去氧氣。為此，將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管，該管連接到裝有惰性氣體（氬氣或氮氣）的氣瓶的壓力調節器。打開非常弱的氣流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接觸液體和管壁。氣流應在液體中形成漩渦而不濺出液體。將保持在該位置 10-20 秒。

   如果同時進行多個標記反應，可以使用離心濃縮器進行脫氣。為此，將管子放入濃縮器中，打開旋轉，打開真空 30-40 秒，然后關閉真空，同時向系統輸入端輸送惰性氣體。

7. 添加活化劑溶液（抗壞血酸），然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關閉它。

8. 渦旋溶液。

9. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時。

10. 使用透析或尺寸排阻色譜分離染料-蛋白質綴合物。