炔烴修飾的寡核苷酸與染料疊氮化物的綴合

點擊化學緩沖液適用于含有炔烴的寡核苷酸的合成后綴合。帶有末端炔的寡核苷酸可以使用炔亞磷酰胺合成，或者您也可以在我們的網站上訂購修飾寡核苷酸的合成。

疊氮化物與修飾寡核苷酸的末端炔綴合，形成五元雜環。這兩個基團（疊氮基和炔烴）在天然生物分子中都極為罕見，因此該反應具有高度特異性，可以有效地處理各種任務。

該反應在銅 (I) 存在下、中性 pH 值下進行。催化緩沖液含有銅 (II)、醋酸三乙銨 pH 7 和 DMSO。建議使用新配制的 抗壞血酸溶液來還原銅 (II)。

對于此反應，您將需要炔烴修飾的寡核苷酸、疊氮化染料、點擊化學緩沖液和抗壞血酸。您可以在我們的網站上在線訂購所有試劑。

協議

我們推薦以下方案用于含炔寡核苷酸與疊氮化染料的綴合：

1. 根據要使用的寡核苷酸的量確定總反應體積：

   寡核苷酸的量	總反應體積，μL
   4至20納摩爾	100
   20至40納摩爾	200
   40至80納摩爾	400
   80 至 600 納摩爾	600

2. 使用下表計算標記反應的試劑體積：

   試劑	體積，微升	原液濃度
   疊氮化染料	(寡核苷酸量[nmol])×0.15	10 mM DMSO 溶液
   點擊化學緩沖液	（總反應體積[μL]）×0.67	1.5倍
   活化劑 （抗壞血酸）	（總反應體積[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水（用于溶解寡核苷酸）	（總反應體積 [μL] - 疊氮化染料溶液的體積 [μL] - 緩沖液的體積 [μL] - 活化劑溶液的體積 [μL]）	—

3. 準備疊氮化染料（DMSO 中 10 mM）和活化劑（抗壞血酸，水中 50 mM） 的儲備溶液 。

   請記住，抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液（該溶液在 1 天內穩定）。要制備儲備溶液，請將 10 mg抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 將寡核苷酸溶解在 2 mL 塑料管中 計算體積的 水中。

5. 添加點擊化學緩沖液和渦旋。

6. 添加計算體積的疊 氮化染料儲備溶液并再次渦旋。

7. （受到推崇的）。將混合物脫氣以除去氧氣。為此，將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管，該管連接到裝有惰性氣體（氬氣、氮氣或氦氣）的氣瓶的壓力調節器。打開非常弱的氣流并將頭部放入管中，使其比液位高 3-10 毫米，避免接觸液體和管壁。氣流應在液體中形成漩渦而不濺出液體。將頭部保持在該位置 10-20 秒。

   如果同時運行多個標記反應，則可以使用 SpeedVac 型系統進行脫氣。為此，將管子放入系統中，打開旋轉，打開真空 30-40 秒，然后關閉真空，同時向系統輸入端注入惰性氣體。

8. 添加活化劑溶液（抗壞血酸），然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關閉它。

9. 渦旋溶液。如果反應過程中形成沉淀，請將管在熱水 (70–95 °C) 中加熱，直至沉淀溶解并渦旋溶液。

10. 讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時。

11. 添加 2M 高氯酸鋰溶液（每 5 體積的反應混合物 1 體積），渦旋溶液，并添加額外的純丙酮至 2 mL。

12. 搖動管子并使其在-20°C 下靜置 20 分鐘。

13. 以 10,000 RPM 離心 10 分鐘，分離沉淀物。丟棄上清液。

14. 將 1 mL 丙酮添加到沉淀物中。搖動管數次，并以 10,000 RPM 離心 10 分鐘分離沉淀物。丟棄上清液。

15. 讓沉淀物在室溫下在開口管中干燥 1 小時或將管放入 65°C 的加熱塊中 10 分鐘。

16. 將沉淀物溶解于水中，并通過HPLC純化目標產物