使用 Pico488 進行 DNA 定量

Pico488 DNA 定量溶液是一種超靈敏試劑，用于在無法通過測量 260 nm 吸光度來確定雙鏈 DNA 濃度時測量雙鏈 DNA 濃度。 Pico488 選擇性地結合雙鏈 DNA，因此核苷酸、單鏈 DNA、RNA、蛋白質和其他雜質不會妨礙測量。與雙鏈 DNA 結合的染料在 503 nm 處最大吸收光并在 525 nm 處最大發射光。為了檢測測定讀數，可以使用任何類型的熒光計或熒光板讀數器。

Pico488 測量 DNA 濃度的線性范圍為 1 pg/μL — 5 ng/μL。為了實現精確、可重復的熒光測量，我們建議在 TE 緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA）中稀釋 DNA 和 Pico488。為了計算 DNA 濃度，我們建議首先使用一系列 DNA 標準稀釋液建立校準曲線。

Lumprobe 銷售各種包裝的Pico488 DNA 定量溶液和Pico488 DNA 定量試劑盒。除了 Pico488 溶液之外，該試劑盒還包括緩沖液和 DNA 標準儲備溶液。如果測定體積等于 2 ml，則試劑盒提供的染料溶液量足以分析標準熒光比色皿（體積 3.5 ml）中的 200 個實驗數據點。如果使用其他類型的設備來檢測熒光，則可以重新調整測定范圍。下表提供了常用熒光設備的推薦檢測體積。

協議

1. Pico488工作液的制備

解凍 Pico488 染料瓶中的內容物，充分混合，并用緩沖液將所需量的 Pico488 染料溶液稀釋 200 倍（我們建議使用 10 mM Тris HCl、1 mM EDTA，pH 7.5）?；旌喜⒃?小時內使用。每個實驗數據點的 Pico488 工作溶液體積應等于測定體積的 50%（查看下表以查找適合您的熒光測定設備類型的推薦體積）。為所有實驗數據點（針對您計劃分析的所有樣品和所有 DNA 標準稀釋液）準備足夠的 Pico488 工作溶液。還包括額外 10-25% 的 Pico488 工作溶液體積，以排除可能的移液錯誤。要計算稀釋后的 Pico448 的體積，可以使用以下公式：

V Pico488 = 5/8 × V測定× (N 個樣品+ N 個標準品)， 其中 V測定是樣品或標準品的測定體積，mL，N 個樣品 是您計劃分析的樣品數量，N 個標準品是您計劃分析的標準品數量（包括空白樣品）。

2. 樣品溶液的制備

在緩沖液中稀釋 DNA 樣本，使溶液體積等于測定體積的 50%（您可以使用任意量的 DNA）。添加等體積的 Pico488 工作溶液?；旌喜⒎跤?5 分鐘。同樣，制備 DNA 標準品的稀釋液。請注意，DNA 標準品的稀釋度應在樣品中 DNA 濃度的范圍內。 DNA 標準儲備液僅隨Pico488 DNA 定量試劑盒提供。Pico488 DNA 定量解決方案的用戶 應使用自己的 DNA 標準品。

使用Pico488 DNA 定量溶液進行 DNA 定量的推薦體積：

* 為了保持測量的準確性和精密度，我們建議避免移液量低于 2 µL。

3. 熒光測量

使用適當的吸收和發射波長或濾光片測量標準和樣品 DNA 溶液的熒光（雙鏈 DNA 結合的 Pico488 染料吸收最大波長為 503 nm 的光，發射最大波長為 525 nm 的光）。

4. DNA濃度的計算

繪制熒光與 濃度的關系圖，并在任何軟件中應用線性回歸函數，以獲得反映熒光 ( FL ) 與濃度 ( C ) 依賴性的線性方程：
FL = A × C + B。

要計算稀釋樣品中的 DNA 濃度，請使用以下公式：
C樣品= (FL樣品 — B)/A，其中FL樣品是樣品溶液熒光。

要計算未稀釋樣品中的 DNA 濃度，請使用以下公式：
С init = V Assay × C Sample  / V init，其中 V Assay是測定體積（mL），V init是初始 DNA 樣品的體積（μL）

或者，您可以使用我們的dsDNA 定量和稀釋 計算器完成所有必要的計算。

線性回歸示例：熒光與 DNA 濃度